課題番号：

JPMXP1223MS1073

実施機関：

自然科学研究機構

要約

我々が所有している南極産好冷細菌由来グルコキナーゼ(PsGK)は高熱安定性を有する低温適応酵素である。つまり、PsGKは低温から高温での高い酵素活性と高い安定性を併せ持ち、産業利用に理想的な特徴を有している酵素である。しかし、PsGKのように低温適応と高熱安定性を同時に達成する天然酵素は報告がほとんどなく、また現在の一般論ではそのメカニズムは説明できない。そこで、本研究ではPsGKの分子基盤を解明することを目的とし、これを達成するために、酵素活性および安定性と関係があるとされる構造柔軟性に注目した。グルコキナーゼの酵素反応は開閉運動を伴うため、これまでに行ってきた部位特異的な構造柔軟性を実測に加え、全体的な構造柔軟性として構造ダイナミクスを実測することでPsGKの酵素活性や安定性のメカニズムを明らかにする。構造ダイナミクスの実測には、高速混合凍結-先端ESR法(DEER)を利用する。
PsGKの構造ダイナミクスを解き明かすために、高速混合凍結法とDEERを用いてPsGKの酵素反応に伴う構造変化速度の温度依存性を実測することを目的とした。DEERでは、酵素のドメイン間の距離を測定することで構造変化を追跡できる。また、高速混合凍結によって、種々の温度でインキュベートした酵素と基質を様々な反応速度で混合し瞬間凍結することで反応中間体を作製できる。これらを達成するためには、①DEER測定条件の検討、②DEERによる基質非結合型構造および基質結合型構造の距離測定、③中間体捕捉に適した酵素と基質の混合速度の検討、④高速混合凍結で作製した反応中間体サンプルのDEER測定といったいくつかのステップを経る必要があった。我々の研究対象であるPsGKは金属などのラジカルを保有していないため、ESRで検出するためにはスピンラベル剤を酵素中に導入する必要があった。そのため、分子科学研究所では電子スピン共鳴装置(EMX Plus)を用いてスピンラベル濃度の測定(ラベル率の定量)および電子スピン共鳴装置(E680)を用いてDEER測定を実施した。