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光学顕微鏡で原子レベルの位置決定精度を達成

 大学共同利用機関法人 自然科学研究機構分子科学研究所(分子研)と同 生理学研究所(生理研)は2018年11月28日,分子研 飯野 亮太教授ら,生理研 村田 和義准教授らの研究グループが,光学顕微鏡による金ナノ粒子をプローブとした生体分子の観察における位置決定精度の原理的な限界を解明し,原子レベルの位置決定精度を達成することに成功した,と発表した.本研究は,科学研究費補助金,自然科学研究機構新分野創成センターイメージングサイエンス研究分野プロジェクトの支援を受け,原著論文はBiophysical Journal誌に受理・公開された(注).

 タンパク質や脂質などの生体分子の動作は,目的の生体分子に蛍光色素などの目印(プローブ)を付けることにより光学顕微鏡で観察できる.しかし1分子計測を行うと,光学顕微鏡の空間分解能が光波長の半分程度のため,大きさ数nmの生体分子が約100nmに広がった輝点としてしか捉えられない.ところが,この輝点の中心位置(受光強度分布の重心)は1nmオーダーの精度で捉えられる.その位置精度は検出される光子の数(フォトン数)の平方根に比例して向上するが,プローブに蛍光色素を用いると,蛍光分子が発光しなくなる現象(褪色)が生じるため精度向上が難しい.この困難を乗り越えるため,緑色の励起光と共鳴し,光を強く散乱する金ナノ粒子(AuNP)が蛍光色素の代わりに用いられ始めた.AuNPにより,高い信号光強度が得られ,褪色も起こらない.動画撮影により,マイクロ秒(100万分の1秒)オーダーの時間分解能での観察も達成されたが,金ナノ粒子の位置決定精度の原理的な限界は分かっていなかった.

 これに対し,研究グループは,輪帯照明型の全反射暗視野顕微鏡を独自に開発し,AuNPの粒径,励起光強度などと位置精度との関係を系統的に調べた.

 この結果,粒径40nmのAuNPを,1.3Å,(0.13nm)の位置決定精度1msの時間分解能で観察することに成功した.全反射暗視野顕微鏡は,ガラスと水の界面で光を全反射させ,界面近傍に局在する光を試料に照明して発生した散乱光を検出してS/Nの良い暗視野光学像を得る.これに加えて,リング状に照明することで1点に集中した高強度光による光学系(対物レンズ)の損傷を避けながら,AuNPの励起光強度を高めている.この結果,位置決定精度が励起光強度平方根に比例して向上するという理論予測を確認し,約40μW/μm2の入射光強度で1.3Åの位置精度を得た.この値は時間分解能1msで得られ,精度は入射光総量で決まるので,時間分解能を33μsにすると,5.4Åとなった.また,粒径を小さくすると散乱光強度が下がるため,30nmのAuNPでは時間分解能1msにおいて位置決定精度は1.9Åとなった.

 このようなデータ取得の後,高位置精度・高速の1分子計測として,細胞の物質輸送に関わるモータータンパク質,キネシンが細胞の微小管上を2足歩行する様子を観察し,足の動きを10μs間隔で詳細に追跡することに成功した.

 今後は,生体分子機械の作動原理解明など,生物学・化学分野への貢献を期待している.

(注)Jun Ando, Akihiko Nakamura, Akasit Visootsat, Mayuko Yamamoto, Chihong Song, Kazuyoshi Murata, and Ryota Iino, "Single-nanoparticle tracking with angstrom localization precision and microsecond time resolution", Biophysical Journal, Accepted Manuscript, doi: 1016/j.bpj.2018.11.016; Accepted date 13 November 2018