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疾患と関わる血液中の酵素活性異常を「1分子」レベルで見分ける ~酵素の超感度検出による疾患の早期診断法の確立に期待~

 東京大学,国立研究開発法人 理化学研究所(理研),名古屋市立大学,国立研究開発法人 国立がん研究所(がん研),同法人 科学技術振興機構(JST)は2020年3月12日,東京大学,理研,名古屋市立大学,国立研究開発法人 がん研などからなる研究グループが,血液中の酵素を1分子レベルで区別して検出する方法を開発し,疾患と関わる酵素活性異常を超高感度に検出する病態診断法の可能性を示した,と発表した.本研究はJSTの戦略的創造研究推進事業(さきがけ,CREST),内閣府の革新的研究開発推進プログラム(ImPACT)などの支援を受けて行われ,成果は東京大学大学院 薬学系研究科の浦野 泰照 教授を最終著者としてScience Advabces誌に掲載された(注).

 生体には数千種類を超える酵素が存在し,そのなかには酵素活性の異常が疾患の発生と関連するものもあり,血液中の酵素活性の異常から疾患の有無を判断するバイオマーカーとして疾患の早期診断に用いることが期待されているが,血液中に極微量存在する特定酵素の活性異常の検出には感度が不足する場合が多かった.酵素と反応する蛍光色素分子を蛍光顕微鏡で観測する微量酵素の活性計測技術が1990年代に開発され,この技術を使い,数十フェムトリットルサイズの微小反応容器を多数連結したマイクロチップに酵素溶液を封入し,酵素反応を観察することで1分子レベルの酵素活性を調べることが高精度な生化学研究に活用されている.しかし,血液のように機能未解明のものを含み,数千種類以上もの酵素が存在するサンプル中の特定酵素の活性評価への適用は困難であった.その理由は,マイクロチップ内のそれぞれの反応容器に導入される酵素が特定できず,類似の活性を持つ酵素を見分けられないためである.

 研究グループは,個々の酵素が持つ活性の違いを見分けることで,マイクロチップの反応容器内の酵素の種類を区別することを想起した.蛍光色の異なる複数の有機小分子蛍光プローブ(酵素活性を蛍光シグナルの強度により検出する蛍光色素分子)を用い,酵素活性の違いによる発色の違いから酵素を分離検出するのである.本研究では,肝臓障害をはじめさまざまな疾患の進行で血液中の酵素活性が変化する,リン酸エステル加水分解酵素(アルカリフォスファターゼ:ALP)に着目した.ALPには由来する組織に応じてさまざまなサブタイプがあるが,これまでの酵素活性検出法ではこれらを区別することは出来なかった.実験に用いたALPサブタイプは,臓器非特異的なTNAPと小腸型のALPIであり,配列相同性が50-60%のこれらを区別して1分子検出することが目標である.蛍光プローブに用いる蛍光物質は青,緑,赤の3色で,蛍光分子プローブには,これらの蛍光物質にそれぞれフェノール性エステル基,またはアルコール性エステル基を結合させた分子が開発された.マイクロチップの各容器には酵素1分子が取り込まれるが,それがTNAPかALPIの何れかにより,蛍光プローブ分子に対する分解性の違いから,各容器の蛍光発色に違いが生じる.TNAPとALPIの分別においては,緑と赤の蛍光に着目し,発色している個々の容器の緑分光強度を横軸,赤分光強度を縦軸としてプロットすると,TNAPに由来する分布とALPIに由来する分布が明瞭に分離された.これによりサンプル中のTNAPとALPIの比率を検知することができる.糖尿病患者と健常人の血清を比較すると,糖尿病患者ではALPIの増加が観察された.さらに多様な蛍光プローブの開発により,膵臓がん患者においてはENPP酵素の発現量増加も認められた.

 研究グループは,本研究成果を基に,さらなるバイオマーカーの探索と,疾患の早期診断を可能とするプラットフォームの確立を目指すという.

(注)S. Sakamoto, T. Komatsu, R. Watanabe, Y. Zhang, T. Inoue, M. Kawaguchi, H. Nakagawa, T. Ueno, T. Okusaka, K. Honda, H. Noji, and Y. Urano, "Multiplexed single-molecule enzyme activity analysis for counting disease-related proteins in biological samples", Science Advances, Vol.11, Mar 2020: Vol. 6, no. 11, eaay0888; DOI: 10.1126/sciadv.aay0888