【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.05.13】

課題データ / Project Data

課題番号 / Project Issue Number

24OS0035

利用課題名 / Title

Elucidation of physicochemical properties and functional design of self-assembled nanoparticles

利用した実施機関 / Support Institute

大阪大学 / Osaka Univ.

機関外・機関内の利用 / External or Internal Use

内部利用（ARIM事業参画者以外）/Internal Use (by non ARIM members)

技術領域 / Technology Area

【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）計測・分析/Advanced Characterization（副 / Sub）-

【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）マルチマテリアル化技術・次世代高分子マテリアル/Multi-material technologies / Next-generation high-molecular materials（副 / Sub）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials

キーワード / Keywords

生分解性材料/ Biodegradable material,DDSマテリアル/ DDS material,電子顕微鏡/ Electronic microscope

利用者と利用形態 / User and Support Type

利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)

馬越 大

所属名 / Affiliation

大阪大学 基礎工学研究科

共同利用者氏名 / Names of Collaborators Excluding Supporters in the Hub and Spoke Institutes

渡邉 望美

ARIM実施機関支援担当者 / Names of Supporters in the Hub and Spoke Institutes

利用形態 / Support Type

（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）,技術補助/Technical Assistance

利用した主な設備 / Equipment Used in This Project

OS-004：300kVクライオ電子顕微鏡
OS-011：120kVマルチマテリアル用電顕

報告書データ / Report

概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)

DDS用途としての脂質ナノ粒子の構造や、細胞膜との融合時の構造変化を明らかにすべく、 極低温透過型電子顕微鏡画像の取得を行った。

実験 / Experimental

実験①J774.1細胞から、ショ糖勾配超遠心法を用いてマクロファージ細胞膜小胞を得た後、正電荷脂質DOTAP（1 mol%）添加モノオレイン（MO）またはDOTAP非添加MOで作成した脂質ナノ粒子Cubosomeと超音波処理で混合し、コーティングを行った。得られたナノ粒子をマルチマテリアル用電顕および極低温透過型電子顕微鏡で観察した。極低温透過型電子顕微鏡に関して、2.4 μLの試料を、新たにグロー放電処理したCu QUANTIFOILグリッド（R1.2/1.3、300メッシュ）上に堆積させ、4秒間ブロッティングし、液体エタンに浸した。加速電圧300 kV、デフォーカス値-4 μm、倍率59,000、ピクセルサイズ0.14 nmのTitan KRIOS顕微鏡を用いて画像化した。画像処理および解析はImageJを使用して実行した。実験②Cubosomeは、モノオレイン粉末をクロロホルムに溶解し、真空下で48時間クロロホルムを除去して脂質フィルムを形成することで調製した。脂質フィルムは、F127またはF108の異なる濃度の予熱溶液で水和し、総脂質濃度が50 mMとなるようにした。脂質/F127の重量比は、特に記載がない限り100:0.5とした。その後、サンプルはプローブソニケーター（TOMY Ultrasonic Disruptor UD-200）を用いて氷浴中で100 Wで3分間ホモジェナイズした。最後に、サンプルを70 °Cで3分間加熱した。細胞モデルとして作成したリポソーム25mMと上記で作成したCubosome50mMを体積比1:1で混合し、混合の溶液を2.4μLとり実験①と同上の手順で極低温透過型電子顕微鏡で観察した。

結果と考察 / Results and Discussion

実験①本研究で作製したモノオレインのみのCB、DOTAPをドープしたCB、マクロファージ膜カモフラージュされたカチオン性CBを、それぞれMOのみのCB、カチオン性CB、MM@CBと呼ぶ。TEM 画像ではカチオン性 CB が円形または四角形の形態を呈していることが示された（図1左上）。 細胞膜カモフラージュ後、画像ではカチオン性 CB の表面変化の明確な証拠が観察された。 これらの表面変化は、カチオン性 CB の表面に付着または融合した細胞膜に関連していると考えられる。 クライオ TEM 画像から取得した高速フーリエ変換 (FFT) により、内部立方相の存在が確認された。 カチオン性 CB の場合、 Q_II^P相の特徴的なモチーフと反射が FFT 分析で確認された。 MM@CB (1 : 1 MO 対タンパク質重量比) では、 Q_II^Dと Q_II^Pの共存が観察された（図1右上）。
実験②混合前のキュボソームの粒子サイズは150～300nmであった。キュボソームは立方晶相に特徴的な明確な内部構造を示し、高速フーリエ変換（FFT）により、Q_II^P立方晶相の反射が明らかになった。DOPCリポソームと混合してから約300秒後、MOキュボソームで観察された内部構造の格子パターンは完全に消失し、ラメラ構造を持つ粒子が観察された。しかし、t≈30秒では、キュボソームとラメラ小胞の両方が共存し、ラメラ小胞の割合が高くなっているのが観察された（図1下）。これらの結果は、リポソームと相互作用する際にキュボソーム構造がQ_II^P相からラメラ相へと遷移するというTR-SAXS解析から得られた結論を裏付けるものである。さらに、SAXS回折図における強度の減少と高q値へのシフトは、クライオTEM像においてキュボソーム内部構造が縮小し、小胞の割合が増加していることからも視覚的に確認できた。

図・表・数式 / Figures, Tables and Equations

図1　（上）実験①：マクロファージ膜修飾Cubosomeの設計　（下）実験②：細胞膜モデルと融合した場合のCubosomeの構造変化

その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)

本研究は、JSPS科研費JP21H04628、JP23K26616、およびJP23H01924の支援を受けて実施されました。放射光実験は、高輝度光科学研究センター（JASRI）の承認を得て、SPring-8のBL40XUで実施されました（課題番号2022B0308、2022B0301、および2022B2094）。TR-SAXS実験中に貴重なご支援をいただいた太田昇博士（日本高輝度光科学研究センター）に感謝の意を表します。

成果発表・成果利用 / Publication and Patents

論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)

1. Xuehui Rui, Preparation and characterization of macrophage membrane camouflaged cubosomes as a stabilized and immune evasive biomimetic nano-DDS, Journal of Materials Chemistry B, 12, 8702-8715(2024).
   DOI: doi.org/10.1039/D4TB01063A
   
2. Ward Wakileh, Investigation of Cubosome Interactions with Liposomal Membranes Based on Time-Resolved Small-Angle X-ray Scattering and Laurdan Fluorescence Spectroscopy, The Journal of Physical Chemistry B, 129, 2461-2470(2025).
   DOI: doi.org/10.1021/acs.jpcb.4c06060
   
3. Ward Wakileh, Investigation of Cubosome Interactions with Liposomal Membranes Based on Time-Resolved Small-Angle X-ray Scattering and Laurdan Fluorescence Spectroscopy, The Journal of Physical Chemistry B, 129, 2461-2470(2025).
   DOI: doi/10.1021/acs.jpcb.4c06060
   

口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.

特許 / Patents

特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件