【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.05.04】
課題データ / Project Data
課題番号 / Project Issue Number
24CT0229
利用課題名 / Title
機械学習を利用した変異導入による可溶性発現の概念の解明
利用した実施機関 / Support Institute
公立千歳科学技術大学 / Chitose IST
機関外・機関内の利用 / External or Internal Use
内部利用（ARIM事業参画者）/Internal Use (by ARIM members)
技術領域 / Technology Area
【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）物質・材料合成プロセス/Molecule & Material Synthesis（副 / Sub）-
【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials（副 / Sub）-
キーワード / Keywords
バイオセンサ/ Biosensor
利用者と利用形態 / User and Support Type
利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)
松井 大亮
所属名 / Affiliation
公立千歳科学技術大学理工学部応用化学生物学科
共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes
ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes
利用形態 / Support Type
（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-
利用した主な設備 / Equipment Used in This Project
報告書データ / Report
概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)
異種発現系で酵素遺伝子を発現させた場合、封入体の形成し、活性を示さないことが多く、このことは異種宿主による酵素の大量発現における大きな問題点である。これまでに大腸菌で不溶性画分に発現する植物由来酵素遺伝子への変異導入による可溶性発現や、二次構造やアミノ酸配列の保存性、疎水性度に着目した変異導入法による可溶性発現手法を研究してきた。本研究では高度好熱菌由来タンパク質のアミノ酸配列と大腸菌における各々の発現情報を機械学習に入力し、得られた計算結果を用いて可溶性確率が高い置換部位を選抜、変異導入による可溶性発現への効果を検討した。
実験 / Experimental
高度好熱菌由来のタンパク質の異種発現情報の取得：理研バイオリソース研究センターから購入したThermus thermophilus HB8のタンパク質発現用プラスミド414種類を各々大腸菌BL21(DE3)に挿入し、抗生物質を添加したLB液体培地で37度振盪培養し、菌体濁度が0.5の時にイソプロピル-b-チオガラクトピラノシドを添加後、16度で12時間誘導した。その菌体を超音波破砕後、上清を可溶性画分、沈殿を不溶性画分とし、SDS-PAGEで発現情報を取得した。機械学習：教師付き学習技術の一つであるニューラルネットワークで学習を実施した。上記タンパク質群の70%のアミノ酸配列と発現量の情報を計算機に導入し、可溶性に発現する割合（可溶性確率）を算出し、残り30%の配列情報をその計算機に入れ、可溶性確率を算出し、実際の発現量と比較することで正答率を確認した。変異導入と活性測定： PCRにより変異導入し、比色定量法や吸光度変化による活性測定を行った。
結果と考察 / Results and Discussion
255種のタンパク質が可溶性画分、159種のタンパク質が不溶性画分に大腸菌で発現することを明らかにした。機械学習により、およそ75%の精度で可溶性確立を予測することができ、その計算機を用いて数種の酵素配列に対し、一残基ずつ他のアミノ酸に置換した酵素の可溶性確率を算出し、可溶性確率が高い置換部位を見出した。その部位への変異導入し、大腸菌で発現した結果、Arginine decarboxylaseで18変異体中8変異体（44%）、Catechol 2,3-dioxygenaseで20変異体中14変異体（70%）、Glutamate dehydrogenaseで20変異体中16変異体（80%）、Lactate dehydrogenaseで19変異体中7変異体（37%）に、可溶性画分の活性の検出や増加が見られた。計算機で予測した部位への変異導入による効果が見られない酵素もあり、詳細なタンパク質の可溶性発現の機構を解明する必要性があるが、この新たな取り組みを、化学工業および医療産業などに有効に利用することが大いに期待できる。
図・表・数式 / Figures, Tables and Equations
その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)
成果発表・成果利用 / Publication and Patents
論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)
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Ayuta Nakahara, Improvement of Heterologous Soluble Expression of L‐amino Acid Oxidase Using Logistic Regression, ChemBioChem, 25, (2024).
DOI: 10.1002/cbic.202400243
口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.
特許 / Patents
特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件