【公開日:2025.06.10】【最終更新日:2025.04.24】
課題データ / Project Data
課題番号 / Project Issue Number
24NM0038
利用課題名 / Title
転写因子の量依存的発現調節に関わるタンパク質の同定
利用した実施機関 / Support Institute
物質・材料研究機構 / NIMS
機関外・機関内の利用 / External or Internal Use
外部利用/External Use
技術領域 / Technology Area
【横断技術領域 / Cross-Technology Area】(主 / Main)物質・材料合成プロセス/Molecule & Material Synthesis(副 / Sub)計測・分析/Advanced Characterization
【重要技術領域 / Important Technology Area】(主 / Main)次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials(副 / Sub)-
キーワード / Keywords
iPS細胞,質量分析/ Mass spectrometry,細胞・組織再生誘導材料/ Materials for inducing cell and tissue regeneration
利用者と利用形態 / User and Support Type
利用者名(課題申請者)/ User Name (Project Applicant)
西村 健
所属名 / Affiliation
筑波大学 医学医療系
共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes
ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes
服部晋也
利用形態 / Support Type
(主 / Main)機器利用/Equipment Utilization(副 / Sub)-
利用した主な設備 / Equipment Used in This Project
NM-002:LC-MS(Q-Exactive Plus)
NM-020:LC-MS(Orbitrap Exploris 480)
報告書データ / Report
概要(目的・用途・実施内容)/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)
iPS細胞誘導時には、多能性維持・誘導に関係する遺伝子の発現が、様々なエピジェネティックな制御機構によって上昇する。我々は、iPS細胞誘導遺伝子のうちKLF4の量によってiPS細胞の多能性が異なる現象を発見している。このようなKLF4量依存的多能性誘導機構を明らかにするために、多能性を制御する遺伝子の一つであるNanog遺伝子に着目し、Nanogのプロモーター上で、高発現の場合のみKLF4が結合する領域に結合している他のタンパク質の同定を試みた。そのために、特定のDNAに結合しているタンパク質やDNA、RNAの分離が可能な、CAPTURE2 system (Liu et al. Genome. Biol, 2020)を利用した。このsystemでは、解析対象となるゲノムDNAの近傍に結合するガイドRNAを設計し、ガイドRNAとdCas9タンパク質を細胞に導入する。そして、cross-link後にdCas9タンパク質を回収することにより、標的とするゲノムDNAに結合するタンパク質を分離することが可能である。
実験 / Experimental
そこでまず、Nanog遺伝子プロモーター上の高発現KLF4特異的結合領域に対して、ガイドRNAをデザインした。そして、そのガイドRNAを用いてCAPTURE2 systemで、KLF4高発現iPS細胞、KLF4低発現iPS細胞において上記領域に結合するタンパク質を回収した。得られたタンパク質を同定するために、LC/MS/MSを用いた質量分析を行った。
結果と考察 / Results and Discussion
質量分析の際に、より多くのタンパク質を同定するために、従来のQ-Exactive Plusよりも感度が高いと考えられるOrbitrap Exploris 480でも質量分析を行い、同定されたタンパク質の数を比較した。その結果、いずれのサンプルでも、Orbitrap Exploris 480において二倍以上のタンパク質が検出された(図)。
図・表・数式 / Figures, Tables and Equations
Orbitrap Exploris 480 (OE) とQ-Exactive Plus (QE) で同定されたタンパク数の比較
その他・特記事項(参考文献・謝辞等) / Remarks(References and Acknowledgements)
機器の使用、解析について多大なる支援をしていただきました、NIMSバイオ分析ユニットの服部晋也さんに深く御礼申し上げます。
成果発表・成果利用 / Publication and Patents
論文・プロシーディング(DOIのあるもの) / DOI (Publication and Proceedings)
口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.
特許 / Patents
特許出願件数 / Number of Patent Applications:0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents:0件