【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.04.24】

課題データ / Project Data

課題番号 / Project Issue Number

24NM0038

利用課題名 / Title

転写因子の量依存的発現調節に関わるタンパク質の同定

利用した実施機関 / Support Institute

物質・材料研究機構 / NIMS

機関外・機関内の利用 / External or Internal Use

外部利用/External Use

技術領域 / Technology Area

【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）物質・材料合成プロセス/Molecule & Material Synthesis（副 / Sub）計測・分析/Advanced Characterization

【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials（副 / Sub）-

キーワード / Keywords

iPS細胞,質量分析/ Mass spectrometry,細胞・組織再生誘導材料/ Materials for inducing cell and tissue regeneration

利用者と利用形態 / User and Support Type

利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)

西村 健

所属名 / Affiliation

筑波大学　医学医療系

共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes

ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes

服部晋也

利用形態 / Support Type

（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-

利用した主な設備 / Equipment Used in This Project

NM-002：LC-MS（Q-Exactive Plus）
NM-020：LC-MS（Orbitrap Exploris 480）

報告書データ / Report

概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)

iPS細胞誘導時には、多能性維持・誘導に関係する遺伝子の発現が、様々なエピジェネティックな制御機構によって上昇する。我々は、iPS細胞誘導遺伝子のうちKLF4の量によってiPS細胞の多能性が異なる現象を発見している。このようなKLF4量依存的多能性誘導機構を明らかにするために、多能性を制御する遺伝子の一つであるNanog遺伝子に着目し、Nanogのプロモーター上で、高発現の場合のみKLF4が結合する領域に結合している他のタンパク質の同定を試みた。そのために、特定のDNAに結合しているタンパク質やDNA、RNAの分離が可能な、CAPTURE2 system (Liu et al. Genome. Biol, 2020)を利用した。このsystemでは、解析対象となるゲノムDNAの近傍に結合するガイドRNAを設計し、ガイドRNAとdCas9タンパク質を細胞に導入する。そして、cross-link後にdCas9タンパク質を回収することにより、標的とするゲノムDNAに結合するタンパク質を分離することが可能である。

実験 / Experimental

そこでまず、Nanog遺伝子プロモーター上の高発現KLF4特異的結合領域に対して、ガイドRNAをデザインした。そして、そのガイドRNAを用いてCAPTURE2 systemで、KLF4高発現iPS細胞、KLF4低発現iPS細胞において上記領域に結合するタンパク質を回収した。得られたタンパク質を同定するために、LC/MS/MSを用いた質量分析を行った。

結果と考察 / Results and Discussion

質量分析の際に、より多くのタンパク質を同定するために、従来のQ-Exactive Plusよりも感度が高いと考えられるOrbitrap Exploris 480でも質量分析を行い、同定されたタンパク質の数を比較した。その結果、いずれのサンプルでも、Orbitrap Exploris 480において二倍以上のタンパク質が検出された（図）。

図・表・数式 / Figures, Tables and Equations

Orbitrap Exploris 480 (OE) とQ-Exactive Plus (QE) で同定されたタンパク数の比較

その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)

機器の使用、解析について多大なる支援をしていただきました、NIMSバイオ分析ユニットの服部晋也さんに深く御礼申し上げます。

成果発表・成果利用 / Publication and Patents

論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)

口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.

特許 / Patents

特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件