【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.04.23】

課題データ / Project Data

課題番号 / Project Issue Number

24NM0139

利用課題名 / Title

微生物の環境変動に応答したタンパク質発現挙動の理解

利用した実施機関 / Support Institute

物質・材料研究機構 / NIMS

機関外・機関内の利用 / External or Internal Use

外部利用/External Use

技術領域 / Technology Area

【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）物質・材料合成プロセス/Molecule & Material Synthesis（副 / Sub）-

【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials（副 / Sub）-

キーワード / Keywords

微生物,抗菌・抗ウイルス材料/ Antibacterial/antiviral materials, 質量分析/ Mass spectrometry

利用者と利用形態 / User and Support Type

利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)

桝尾 俊介

所属名 / Affiliation

筑波大学　生命環境系

共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes

ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes

服部晋也

利用形態 / Support Type

（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-

利用した主な設備 / Equipment Used in This Project

NM-020：LC-MS（Orbitrap Exploris 480）
NM-002：LC-MS（Q-Exactive Plus）

報告書データ / Report

概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)

自然環境中の細菌や酵母、カビなどの微生物は、高温、低温、化学薬品など様々な外的ストレスに応答して代謝を変動させることで、多様な環境に適応している。微生物のタンパク質発現挙動を明らかとすることは、これらの応答・適応システムを理解するために非常に重要である。また、これを理解することは微生物の生育を制御するために必要不可欠であり、新たな抗菌材料などの開発につながると期待される。本研究課題では、細菌とカビなどの様々な微生物のタンパク質の発現挙動とその制御機構を理解することを目的として、LC-MS を用いたプロテオミクス解析を行った。

実験 / Experimental

GFPタグが付加された融合タンパク質を発現する組換えカビを作製した。本株とGFPを発現しないコントロール株の胞子をそれぞれ液体最少培地に植菌し、25℃、120 rpmで40 h 振盪培養した。培養後の菌体を破砕し、無細胞抽出液を取得した。15 mg/mlのタンパク質濃度に調製した無細胞抽出液 1 mlにGFP-trapビーズを添加し、4℃で２h インキュベートした。ビーズを洗浄後、SDSサンプルバッファーを用いて吸着タンパク質を溶出した。溶出液をSDS-PAGEにより1 cmほど分離した後ゲルを切り出し、トリプシンを用いたin gel digestion によりペプチド溶液を調製した。LC-MS（Q-Exactive Plus）あるいはLC-MS（Orbitrap Exploris 480）のData-dependent acquisition modeでペプチドを分析し、MaxQuantを用いてタンパク質の同定・定量を行った。

結果と考察 / Results and Discussion

カビの生育に必須な機能未知因子の機能を明らかとするため、免疫沈降を用いた相互作用因子の探索を行った。GFPタグを付加した融合タンパク質発現株の無細胞抽出液とGFP-trapビーズを用いた免疫沈降を行った。当該タンパク質と共沈降したタンパク質をLC-MSを用いて同定した。その結果、タグなしのコントロールに比べ優位に濃縮されたタンパク質が100種類以上同定された。これらの中にはカビの生育に必須なタンパク質も多く含まれていた。今後これら因子の相互作用とそれぞれの機能に関する詳細な解析により、カビの生育に必須な機能未知因子の役割を明らかにできると期待される。

図・表・数式 / Figures, Tables and Equations

その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)

成果発表・成果利用 / Publication and Patents

論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)

口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.

特許 / Patents

特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件