【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.05.07】
課題データ / Project Data
課題番号 / Project Issue Number
24TU0152
利用課題名 / Title
糖鎖特性解析
利用した実施機関 / Support Institute
東北大学 / Tohoku Univ.
機関外・機関内の利用 / External or Internal Use
外部利用/External Use
技術領域 / Technology Area
【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）計測・分析/Advanced Characterization（副 / Sub）-
【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials（副 / Sub）-
キーワード / Keywords
高分子系生体材料,核磁気共鳴/ Nuclear magnetic resonance,質量分析/ Mass spectrometry,バイオアダプティブ材料/ Bioadaptive materials
利用者と利用形態 / User and Support Type
利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)
坂本 泉
所属名 / Affiliation
株式会社糖鎖工学研究所
共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes
上松亮平,橋本奈央子
ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes
權垠相
利用形態 / Support Type
（主 / Main）共同研究/Joint Research（副 / Sub）-
利用した主な設備 / Equipment Used in This Project
TU-604：質量分析計
TU-602：核磁気共鳴分光装置
TU-603：核磁気共鳴分光装置
報告書データ / Report
概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)
目的：生体成分である糖鎖構造の精密分析
用途：医薬品原料及び中間体
実施内容：NMR及びMSによる糖鎖構造決定
実験 / Experimental
成果１：
測定試料にはAsn残基のアミノ基がFmoc基で保護されたFmoc-Asn G1M9を用いた。
先ず、FTMSによる精密質量で測定試料が目的物含有であることを確認し、精密質量が一致したものをNMR測定により位置及び立体について、1H, 13C, 選択励起1D-1H TOCSYの各一次元NMRスペクトル、および1H-1H COSY, NOESY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC, 1H-13C HSQC-TOCSYの各二次元NMRスペクトルを測定した。得られたスペクトルを解析し、Fmoc-Asn G1M9の1H, 13Cシグナルの帰属を行った。
成果２：
アクセプターとしてガラクトースもしくは2-Aminobenzamide (2-AB）標識したガラクトース、シアル酸ドナーにCMP-シアル酸、100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)に溶解させ、Pasteurella multocida由来α(2-3) Sialyltransferaseを用いて転移反応検討を行った。反応生成物は2-Aminobenzamide (2-AB)で標識化した後にLC/MSにて分析した。
結果と考察 / Results and Discussion
成果１：
測定対象物がFTMS測定により、目的物含有であることを精密質量結果により確認した。
その後、1H NMRスペクトルにおいて、レポーターグループとして4.0-5.0 ppmに観測される各糖のアノマー位、およびマンノース2位の1Hシグナルに着目し、HSQC, HSQC-TOCSY各スペクトルを解析し、G1M9を構成する各糖の1H, 13Cシグナルの帰属を行った。グリコシド結合の位置はHMBCスペクトル解析により決定した。マンノースのアノマープロトンのシグナルに重複がみられたが、NOESYスペクトルの解析によりこれらを区別し帰属できた。本研究の帰属結果は既知のG1M9部分構造の帰属結果とも良い一致を示し、Fmoc-Asn G1M9の1H, 13Cシグナルの完全帰属を達成したと結論付けた。
成果２：
シアル酸転移後に2-AB化標識した場合、既知情報通りガラクトースの3位にシアル酸が転移した。一方、2-AB化した後に、同一条件にてシアル酸転移を行った場合においては、6位選択的にシアル酸が転移していることがわかった。このことは、標識化により閉環構造と開環構造を制御することで、同じ酵素を用いたライブラリー化が可能であることを示唆している。現在、化学合成した遊離Core 1構造(Galβ1-3GalNAc、T抗原)に対して検討をおこなっている。
図・表・数式 / Figures, Tables and Equations
その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)
本測定には東北大学巨大分子解析研究センターの權 垠相 准教授、門馬洋行助手及び技術職員 吉田 慎一朗 氏には多大なる御協力をいただきました。
また成果１は東北医科薬科大分子生体膜研究所山口芳樹教授、真鍋法義講師による共同研究により実施いたしました。
この場をお借りし御礼を申し上げます。誠にありがとうございました。
成果発表・成果利用 / Publication and Patents
論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)
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Ryohei Uematsu, Complete assignment of 1H and 13C NMR signals of monoglucosylated high-mannose type glycan attached to asparagine, Carbohydrate Research, 552, 109468(2025).
DOI: https://doi.org/10.1016/j.carres.2025.109468
口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.
- 上松 亮平1 、橋本 奈央子1 、坂本 泉1、吉田 慎一朗2、真鍋 法義3、金谷 章生1 、權 垠相2 、山口 芳樹3 (1. 株式会社糖鎖工学研究所、2. 東北大院理巨大分子解析研究センター、3. 東北医科薬科大分子生体膜研究所)、日本薬学会第145年会(福岡)、2025年3月26日～29日
- 橋本奈央子１、上松亮平１ 、野口真人１ 、門馬洋行2 、吉田慎一朗2 、金谷章生1 、權垠相2 、坂本泉1, ３(１：糖鎖工学研究所 ２：東北大院理巨大分子解析研セ ３：東北大院医)、日本薬学会第145年会(福岡)、2025年3月26日～29日
特許 / Patents
特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件